2.8 色谱法分离提纯有机化合物（Separation and Purification of Organic Compounds by Chromatography）
前边介绍了蒸馏、萃取、重结晶和升华等有机化合物的提纯方法。然而，经常遇到化合物的物化性质十分相近的情况，用以上的几种方法均不能得到较好的分离，此时，可选用色谱分离技术。
色谱法又称色层法、层析法，与经典的分离提纯手段（蒸馏、萃取、重结晶和升华等）相比，具有微量、快速、简便和高效率等优点，是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法之一，已广泛地应用于化学化工、食品、医药等领域。
色谱法的基本原理是利用被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其他亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。流动的混合溶液称为流动相；固定的溶液称为固定相（可以是固体或液体）。根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱、亲和色谱等；根据操作条件的不同，又可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。
2.8.1 薄层色谱（http://202.118.167.67/jpkdata/video/yjhx22/yjhxsy/sepufa-3.htm）
薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）法是把吸附剂或支持剂铺在玻璃板上，将样品点在其上，然后用溶剂展开，使样品中的各个组分相互分离的方法。薄层色谱不仅适用于少量样品（几微克，甚至0.01μg）的分离，也适用于较大量样品（多达500mg）的精制，特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。
2.8.1.1 薄层色谱原理
根据组分在固定相中的作用原理不同，薄层色谱分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱和离子交换色谱等，这里主要介绍吸附薄层色谱。
吸附薄层色谱是使用最广泛的方法，其原理是在层析（展开）过程中，被分离的物质同时受到固定相吸附剂的吸附和流动相溶剂（展开剂）的溶解（解吸）作用。由于混合物不同，物质与吸附剂之间的吸附能力不同，以及不同物质在展开剂中的溶解度不同，因此，当吸附和解吸达到平衡时，不同物质在吸附剂和展开剂之间的质量分配比不同。随着展开剂向前移动，物质在吸附剂和展开剂之间的暂时平衡又被不断移动上来的展开剂所破坏，使部分溶质解吸并随展开剂向前移动，形成了吸附-解吸-吸附-解吸的交替过程。与吸附剂吸附能力小且在展开剂中溶解度大的物质移动得较快；相反，与吸附剂吸附能力大的，在展开剂中溶解度小的物质移动得较慢。这样不同的物质便由于移动速率的不同而到达不同的高度，从而得到分离。
应用吸附薄层色谱进行分离鉴定的方法是：将被分离鉴定的物质用毛细管点在薄层板的一段，晾干或吹干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度0.5cm。待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将薄层板取出并让其干燥，直至不再含溶剂为止。若原先点在板上的混合物已被分开，在板上会有一排竖直排列的斑点，每一斑点相当于从原混合物中分离得到的组分或化合物。若混合物的组分都是有色物质，则展开后可以清晰地看出各个斑点；若组分是无色的，则喷以显色剂，或在紫外灯下显色，使其成为可以看得见的斑点。
一个化合物在薄层板上上升的高度与展开剂上升的高度的比值称为该化合物的比移值Rf：
如图2-34所示的展开后的薄层板，则化合物1的比移值Rf，1=a/c，化合物2的比移值Rf，2=b/c。
图2-34 比移值Rf图示
影响Rf的因素很多，如薄层的厚度、吸附剂、展开剂、温度等。但是在固定条件下，某化合物的比移值Rf是一常数。因此在完全相同情况下，可以作为鉴定和检出该化合物的指标。为了得到相同的色谱条件，通常把未知样和标准样同时点在同一块薄层板上，进行比较。
通常最理想的Rf在0.4～0.5之间，良好的分离Rf在0.15～0.75之间，如果Rf小于0.15或大于0.75，则分离效果不好，就要调换展开剂重新展开。
（1）吸附剂 吸附薄层色谱常用的吸附剂为硅胶和氧化铝。为了增加薄层的强度，一般常加入一定的黏合剂，如石膏、羧甲基纤维素钠、淀粉、聚乙烯醇等。通常薄层板按是否加黏合剂分为两种，加黏合剂的薄层板称为硬板，不加黏合剂的薄层板称为软板。
硅胶是无定形多孔物质，略具酸性，适用于酸性和中性物质的分离分析。商品薄层色谱用的硅胶分为：“硅胶H”——不含黏合剂和其他添加剂的色谱分离用硅胶；“硅胶G”——含煅石膏作黏合剂的色谱分离用硅胶；“硅胶HF254”——含荧光物质的色谱分离用硅胶；“硅胶GF254”——含煅石膏、荧光物质的色谱分离用硅胶，可在波长254nm紫外光下观察荧光。
氧化铝在薄层色谱中的应用范围仅次于硅胶吸附剂。氧化铝是由氢氧化铝于400～500℃灼烧而成的，因制备方法和处理方法的差别，氧化铝有弱碱性（pH=9～10）、酸性（pH=4～5）及中性（pH=7～7.5）之分，因此其使用范围也有所不同。弱碱性氧化铝适于分离中性或碱性化合物，中性氧化铝适用于酸性或对碱不稳定的化合物的分离，酸性氧化铝适用于酸性化合物的分离。与硅胶一样，商品的氧化铝也因含黏合剂或荧光剂而分为氧化铝G（含石膏9％～10％）、氧化铝H（不含黏合剂）、氧化铝HF254（含荧光物质，可于波长254nm紫外光下观察荧光）及氧化铝GF254（既含煅石膏又含荧光剂）。
吸附剂分为极性吸附剂和非极性吸附剂，氧化铝、硅胶属极性吸附剂，且氧化铝的极性比硅胶大，适用于分离极性小的化合物（烃、醚、醛、酮、卤代烃等），因为极性化合物被氧化铝较强烈地吸附，不易被解吸下来，Rf很小。相反，硅胶适用于分离极性较大的化合物（羧酸、醇、胺等），因为极性化合物在硅胶板上吸附较弱，Rf很大。
极性吸附剂的活性与其含水量有关，含水量越低，活性越高。吸附剂的活性与含水量的关系见表2-8。氧化铝由于Ⅰ级的吸附作用太强，Ⅴ级的吸附作用太弱，一般采用Ⅱ、Ⅲ级。
表2-8 吸附剂活性与含水量的关系
（2）展开剂 薄层色谱的流动相也称作展开剂。展开剂的选择直接关系到能否获得满意的分离效果，是薄层色谱法的关键所在。
薄层色谱展开剂的选择，主要是根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑。一般的原则是，被分离物质和展开剂之间的极性关系应符合“相似相溶原理”，即被分离物质的极性较小，展开剂的极性也就较小；被分离物质的极性较大，展开剂的极性也就较大。各种溶剂极性按如下顺序递增：
己烷和石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<三氯甲烷<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸
选择展开剂时，除参照所列溶剂极性来选择外，更多地采用在一块薄层板上进行试验的方法：
①若所选展开剂使混合物中所有的组分点都移到了溶剂前沿，此溶剂的极性过强；
②若所选展开剂几乎不能使混合物中的组分点移动，留在了原点上，此溶剂的极性过弱。
当一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物，若展开不好，用极性较大的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，再次试验，直到选出合适的展开剂组合。合适的混合展开剂常需多次仔细选择才能确定。
2.8.1.2 操作步骤
薄层色谱法的整个过程一般包括制备薄层板、薄层板活化、点样、展开、显色等步骤。
（1）制备薄层板 薄层板制备得好坏直接影响色谱的结果。薄层应尽量均匀而且厚度（0.25～1mm）要固定，否则，在展开时溶剂前沿不齐，色谱结果也不易重复。
根据制法的不同，可将薄层板分为普通薄层板和特殊薄层板，普通薄层板的制备有干法和湿法两种。干法制板一般用氧化铝作吸附剂，涂层时不加水，一般不常使用。这里主要介绍湿法制板。
湿法制板是将吸附剂（硅胶、氧化铝等）用黏合剂的溶液调制成糊状后均匀地涂布在薄板（常用玻璃板）上。在薄层色谱中，用这种方法制板最多。普通湿法制板按操作过程不同分为平铺法、倾注法和浸渍法等。
①平铺法 用商品或自制的薄层涂布器进行制板（见图2-35），一般在大量铺板和铺较大的板时常用此法。如无涂布器，可将调好的吸附剂平铺在玻璃板上，也可得到厚度均匀的薄层板。
图2-35 薄层涂布器
②倾注法 将吸附剂调成糊状，趁浆料有黏稠感、但无凝滞现象前倒在玻璃板上，先轻轻左右摇动，再上下摇动，并轻轻敲打均匀后，放在水平平台上自然干燥即制成。
③浸渍法 把两块干净玻璃片背靠背贴紧，浸入调制好的吸附剂中，取出后分开、晾干。
制备好的薄层板要求薄厚均匀，表面不应有纹路，也不应有透过吸附剂能看到玻璃的薄涂料点。
普通制板法制成的薄层板往往由于黏合剂的黏合力小，易碰掉薄层，增加黏合剂又会限制使用范围，而且一块薄层板只能使用一次就作废。为此，用特殊制板法制成能长久使用的烧结薄层板、金属薄层板、聚酯膜薄层板等，有时针对不同用途在吸附剂中还可以添加荧光物质、还原物质锌粉等，制成特殊薄层板。
（2）薄层板活化活化 指用加热的方法除去吸附剂所含的水分，提高其吸附活性的过程。通常将晾干的薄层板置于烘箱中加热活化，活化条件根据需要而定。硅胶板一般在烘箱中慢慢升温，维持105～110℃活化30min。Al2O3板在150～160℃活化4h，可得活性Ⅲ～Ⅳ级的薄板；在200～220℃活化4h，可得活性Ⅱ级的薄板。活化后的薄板应保存在干燥器中备用。
（3）点样 点样方式、点样量及点样设备的选择决定于分析的目的、样品溶液的浓度及被测物质的检出灵敏度。大多数情况下，是把样品溶于挥发性高、沸点低的有机溶剂里制成溶液再点样。
①点状点样 在距薄层板的一端1～1.5cm处画一条线作为起点线。用毛细管吸取样品溶液，垂直地轻轻接触到起点线上，点样斑点直径越小越好，一般不超过2mm，如图2-36所示。因溶液太稀（一般点样的浓度在0.1％～1％之间），一次点样往往不够，如需重复点样，则应待前次点样的溶剂挥发后再在原处点第二次，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，影响分离效果。一块薄层板可以点多个样，但点样点之间的距离以1～1.5cm为宜。
图2-36 毛细管点样
②带状点样 当样品溶液体积较大（1～90μL），而要进行定量点样时，可以借助特定的点样设备（如CAMAG Linomat Ⅳ型自动点样设备）将样品点成带状。带状点样展开后的斑点不仅分辨率明显高于点状点样，而且精密准确，为定量分析提供最佳条件。
（4）展开 展开剂带动样点在薄层板上移动的过程称为展开。展开过程是在充满展开剂蒸气的密闭的容器（又称色谱缸或层析缸）中进行的。除了专用的色谱缸之外，常见的标本玻璃缸、广口瓶、大量筒等也可作为其代用品。
先将配好的展开剂倒入色谱缸内，为使缸内展开剂蒸气快速饱和，可贴缸壁立一块用展开剂浸透了的滤纸，加盖饱和10min左右后，将点好样的薄层板倾斜放入色谱缸中进行展开，薄层板底边插入展开剂，但切勿使点样点浸入展开剂中，如图2-37所示。当展开剂上升到距离薄层板顶端1～1.5cm处时，取出薄层板，立即用铅笔画出展开剂前沿的位置，展开剂挥发后即可显色。
图2-37 薄层色谱展开
薄层层析中展开方法大体可分为普通展开法和多重展开法。
①普通展开法
a.上升法 将点样后的薄层板垂直于盛有展开剂的容器中，这种展开方式适合于含黏合剂的硬板。
b.倾斜上行法 使薄层板与展开剂平面呈一定的角度，无黏合剂的软板，倾斜角度为15°，含有黏合剂的薄层板可以倾斜45°～60°（见图2-38）。
图2-38 倾斜上行法展开
c.下降法 展开剂放在圆底烧瓶中，用滤纸或纱布等将展开剂吸到薄层板的上端，使展开剂沿板下行（见图2-39）。这种连续展开的方法适用于Rf小的化合物。
图2-39 下降法展开
1—溶剂；2—滤纸条；3—薄层板
②多重展开法 当一次展开后化合物得不到很好的分离时，可以采用多重展开的方法进行展开，多重展开主要分为以下两种类型。
a.递次上行法 第一次展开剂到达前沿后，取出板，让展开剂挥发干，再在同一方向用同一种或换成另外一种展开剂展开，如此反复多次，可达到较好的分离效果，适用于不宜分离化合物的分离。
b.双向展开法 使用方形玻璃板铺制薄层，样品点在角上，先向一个方向展开，取出薄层板，挥去展开剂，然后转动90°角的位置，再换另一种展开剂展开。这样，成分复杂的混合物可以得到较好的分离效果。这种方法常用于成分较多、性质比较接近的难分离物质的分离。
（5）显色 若薄层所分离的化合物是有色的，展开后待溶剂挥发后可以直接进行定位。若化合物是不呈颜色的，则必须使用能使被分离物质变得可见的某种试剂或某种方法。能使斑点显色的试剂称为显色试剂，能使斑点变成明显可见的各种检查方法称为显色方法。
①紫外光显色法 如果被分离的样品本身是荧光物质，可以在紫外灯下观察到荧光物质的亮点。如果样品本身不发荧光，可以在制板时，在吸附剂中加入适量的荧光剂或在制好的板上喷上荧光剂（经常使用的是硫化锌和硫化镉的混合物），制成荧光薄层色谱板。荧光板经展开后取出，标记好展开剂的前沿，待溶剂挥发干净后，放在紫外灯下观察，有机化合物在亮的荧光背景上呈暗红色斑点。标记出斑点的形状和位置，计算比移值。
紫外光显色法不仅使用方便，而且被检出物质不被破坏，因此是常用的检出方法。
②显色剂显色法 既无色，又无紫外吸收的物质，可采用显色剂显色法。
a.蒸气显色 最常用的蒸气显色剂是碘。碘能与许多有机物（烷烃和卤代烷除外）反应形成棕色或黄色的配合物。这种显示方法是将几粒碘置于密闭容器中，待容器充满碘的蒸气后，将已展开干燥过的薄层板放入，碘与展开后的有机化合物可逆地结合，斑点即开始出现。当斑点的颜色足够深时，将薄层板从容器中取出，应立即标记出斑点的形状和位置（因为薄层板放在空气中，由于碘挥发，棕色斑点在短时间内即会消失），计算比移值。
其他常用的蒸气显色剂还有液体溴和浓氨水。
b.喷雾显色 将显色剂配成一定浓度的溶液，用喷雾器喷洒在薄层板上，喷雾器与薄层板之间的距离最好为2～3m，不能太近，这样才能使微细雾点均匀喷洒在薄层板上。
常用的显色剂有硫酸、硝酸、高锰酸钾-硫酸、重铬酸钾-硫酸、硝酸银、三氯化铁等，有些无色化合物还可通过将其制成有色衍生物后再点到板上。如可将醛或酮制成2，4-二硝基苯腙，使其成为黄色或橙色化合物，也可待醛或酮在薄层板上经过分离后再喷上2，4-二硝基苯肼试剂。
显色剂种类很多，可以根据具体情况选择合适的显色剂。以上这些显色方法在纸色谱中同样适用。