实验12　柱色谱法分离偶氮苯和邻硝基苯胺（Separation of Azobenzene andortho-Nitroaniline by Colum Chromatography）

【实验目的】

（1）熟悉柱色谱的分离原理和应用；

（2）掌握柱色谱法分离有机化合物的实验操作技术。

【实验原理】

本实验以氧化铝为吸附剂，1，2-二氯乙烷与环己烷等体积混合液为洗脱剂，分离偶氮苯与邻硝基苯胺的少量混合溶液。由于偶氮苯和邻硝基苯胺的结构不同、极性不同，吸附剂对它们的吸附能力不同，因此洗脱剂对它们的解吸速率也不同。极性小、吸附能力弱、解吸速率快的偶氮苯先被洗脱下来，而极性大、吸附能力强、解吸速率慢的邻硝基苯胺后被洗脱下来，从而使两种物质得以分离。由于两组分均有鲜艳的颜色，故不需要显色即可清晰地观察到柱中的分离情况，适合于初学者练习柱色谱操作技能。

【试剂及仪器】

色谱柱：长25cm，内径1cm。

吸附剂：市售中性氧化铝（100～200目，Ⅱ～Ⅲ级）。

待分离混合样：1％偶氮苯的1，2-二氯乙烷溶液与1％邻硝基苯胺的1，2-二氯乙烷溶液的等体积混合液约1mL。

洗脱剂：①1，2-二氯乙烷与环己烷等体积混合液80～100mL；②95％乙醇（备用）。

【基本操作预习】

柱色谱（http://202.118.167.67/jpkdata/video/yjhx22/yjhxsy/sepufa-1.htm）

【实验步骤】

（1）湿装法装柱　将洗净、晾干的色谱柱竖直固定在铁架台上，关闭活塞，注入约为柱容积1/4的洗脱剂。将一小团脱脂棉用洗脱剂润湿，轻轻挤出气泡，用一支干净玻璃棒将其推入柱底狭窄部位（勿挤压太紧），在脱脂棉上加盖一张直径略小于柱内径的滤纸片。将10g中性氧化铝置于小烧杯中，加入洗脱剂调成悬浊状。打开柱下活塞调节流速约1滴/s，将制成的悬浊液在不断搅拌下自柱顶注入，最好一次加完。如吸附剂尚未加完而烧杯中洗脱剂已加完，可再用适量洗脱剂调和后加入柱中。在吸附剂沉积过程中可用套有橡皮管的玻璃棒轻轻敲击柱身以使吸附剂沉积均匀（1）。柱下接的洗脱剂可重复使用。在此过程中应始终保持吸附剂上面有一段液柱。吸附剂加完后关闭活塞，待沉积完全后将一张比柱内径略小的滤纸片（2）用玻璃棒轻轻推入，盖在吸附剂沉积面上。

（2）加样　打开柱下活塞放出柱中液体，待液面降至滤纸片时关闭活塞，将1mL待分离的混合样液沿柱内壁加入。打开活塞，待样液的液面流至滤纸片时关闭活塞。用干净滴管吸取洗脱剂约0.3mL沿加样处冲洗柱内壁。再打开活塞将液面降至滤纸处。依上法重复操作2～3次，直至柱壁和顶部的洗脱剂均无颜色。

（3）洗脱和接收　在色谱柱上装置滴液漏斗，加入大量洗脱剂，打开柱下活塞，控制流出速率为1滴/s（3），柱下以干净锥形瓶接收，观察柱中色带下行情况。随着色带向下行进，逐渐分为两个色带，下方的为橙红或橙黄色，上方为亮黄或微带草绿色，中间为空白带。当前一色带到达柱底时更换接受瓶接收（在此之前接收的无色洗脱剂可重复使用）。当第一色带接收完后（滴出液近无色为止），更换接受瓶接收空白带，继续洗脱至黄色开始滴出，再换一接受瓶接收第二色带，至黄色色带全部洗出为止。如此分别得到两种物质的溶液（4）。

如果两色带间的空白带较宽，在第一色带到柱底时可改用95％乙醇洗脱，以加速色带下行。若空白带较窄，甚至中间为交叉带，则不可用乙醇洗脱，否则将会使后一色带追上前一色带，造成混淆。

本实验操作优劣以柱中色带分布狭窄、前沿整齐、水平，空白带较宽者为佳。

【注意事项】

（1）色谱柱填装是否紧密对分离效果有很大影响。若柱中留有气泡或各部分松紧不匀时，会影响渗流的速率和显色的均匀。但填装时如果过分敲击，又会因吸附剂太紧密而流速太慢。

（2）加入滤纸的目的是在加料时不致把吸附剂冲起而影响分离效果，也可用玻璃毛或石英砂压在吸附剂上面。

（3）洗脱剂的流速一般为每秒1滴，若流速太快，样品在柱中的吸附和解吸过程来不及达到平衡，影响分离效果。若流速太慢，不仅分离时间长，而且有时样品在柱中停留时间过长，可能促使某些成分发生变化。或流动相在柱中下降的速率小于样品的扩散速率，会造成色带加宽、交合甚至无法分离。

（4）在柱色谱分离过程中，必须保证自始至终不要使柱内的液面降到吸附剂表面以下，否则会使柱身出现裂缝和气泡，影响分离效果。

【思考题】

（1）色谱柱中若填装不匀或有气泡、裂缝，对分离效果有何影响？如何避免？

（2）柱色谱中为什么极性大的组分要用极性强的洗脱剂进行洗脱？

（3）若样品中各组分是无色物质，如何收集各组分？

（4）使用氧化铝为吸附剂，用极性溶剂为洗脱剂，混合物中极性小的组分与极性大的组分相比哪一个先被洗脱？为什么？

（5）样品在柱内的下移速率为什么不能太快？如果太快会有什么后果？

2.8.3　纸色谱（http://202.118.167.67/jpkdata/video/yjhx22/yjhxsy/sepufa-2.htm）

纸色谱（纸层析）和薄层色谱一样，主要用于混合物的分离和鉴定。此法一般用于微量有机物的定性分析。优点是操作简单，价格便宜，易于保存；缺点是展开时间较长。纸色谱主要用于多官能团或高极性化合物如糖、氨基酸等的分析分离。

2.8.3.1　基本原理

纸色谱法属于分配色谱的一种，它的分离作用不是靠滤纸的吸附作用，而是以滤纸（高纯度的纤维素制成）作为惰性载体，以吸附在滤纸上的水或有机溶剂为固定相，被水饱和的有机溶剂为流动相，称为展开剂，利用样品各组分在两相中分配系数的不同达到分离的目的。

在滤纸的一定部位点上样品，当流动相沿滤纸流动经过样品点时，即在滤纸上的水与流动相间连续发生多次分配，结果在流动相中具有较大溶解度的物质随展开剂移动的速率较快，而在水中溶解度较大的物质随展开剂移动的速率较慢，这样便能把混合物分开。

通常用比移值（Rf）表示物质移动的相对距离。各种物质的Rf随要分离化合物的结构、滤纸的种类、溶剂、温度等不同而异。但在上述条件固定的情况下，Rf对每一种化合物来说是一个特定数值，因而它可以作为定性分析的依据。由于影响比移值的因素很多，实验数据往往与文献记载不完全相同，因此在未知物鉴定时，通常采用标准样品在同一张滤纸上点样对照。

因为许多化合物是无色的，在色谱分离后，需要在纸上喷某种显色剂，使化合物显色以确定移动距离。不同物质所用的显色剂是不同的。如氨基酸用茚三酮，生物碱用碘蒸气，有机酸用溴酚蓝等。除用化学方法外，也可用物理方法或生物方法来鉴定的。

纸色谱须在密闭的色谱缸中展开，式样多种，图2-41所示的是其中的一种。

2.8.3.2　操作方法

（1）层析用纸　纸色谱用的滤纸，对其质地、纯度及机械强度都有严格要求，实质上是高级滤纸。如Whatman1号和新华1～6型，国产新华牌色谱用滤纸的型号及性能见表2-9。作一般分析时可用新华2号色谱滤纸，若样品较多时可用新华5号厚滤纸。滤纸的质量应厚薄均匀，能吸附一定量的水，大小可自由选择，一般为3cm×20cm，5cm×30cm，8cm×50cm等。

（2）选择展开剂　根据被分离物质的不同，选用合适的展开剂。展开剂应对被分离物质有一定的溶解度。溶解度太大，被分离物质会随展开剂跑到前沿；溶解度太小，则会留在原点附近，使分离效果不好。选择展开剂应注意下列几点。

①能溶于水的化合物，以吸附在滤纸上的水作固定相，以与水相混合的有机溶剂作展开剂。

②难溶于水的极性化合物，以非水极性溶剂（如甲酰胺等）作固定相，以不能与固定相混合的非极性溶剂（如环己烷、苯、四氯化碳等）作展开剂。

③不溶于水的非极性化合物，以非极性溶剂（如液体石蜡）作固定相，以极性溶剂（如水、含水的乙醇等）作展开剂。

当一种溶剂不能将样品全部展开时，可选择混合展开剂。常用的有：丁醇-水（一般用饱和的丁醇）；正丁醇-醋酸-水，比例为4:1:5。

（3）点样　在滤纸的一端2～3cm处用铅笔按图2-42画好起点线，将样品溶于适当的溶剂中，用毛细管吸取样品溶液点于起点线的×处，点的直径不超过5mm，然后将其晾干，溶剂挥发后，再剪去纸条上下手持的部分。

必须注意，整个过程不得用手接触纸条中部，因为皮肤表面沾着的脏物碰到滤纸时会出现错误的斑点。

（4）展开　将滤纸的另一端悬挂在色谱缸的玻璃钩上，使滤纸条下端浸入展开剂中约1cm，展开剂即在滤纸上上升，样品中组分随之而展开，待展开剂上升至终点线时，将滤纸取出，晾干。

上面介绍的仅为上升法中的一种方法，还有下降法和双向色谱法，需要时请参阅其他书刊。

（5）显色　展开完毕后，取出色谱分离用滤纸，画出展开前沿。若化合物本身有色，就可以直接观察斑点。若本身无色，通常可用显色剂喷雾或在紫外灯下观察有无荧光斑点。

（6）计算比移值（Rf）