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第二节 BD960液体培养
液体培养是基于检测微生物代谢而判断是否有细菌生长的，液体培养基由对分枝杆菌生长更快、更易检出的液体肉汤培养基组成。
BACTECTM MGIT 960操作系统培养分枝杆菌
（一）方法原理
在BACTEC TM MGIT TM960操作系统中，是通过检测液体培养基中消耗氧气的量来确定是否有细菌生长的。MGIT培养管底部的硅树脂中含有氧淬灭荧光剂，当细菌生长过程中吸收散布在培养管中的氧气，排放出二氧化碳。随着管中氧气的逐渐损耗，荧光剂不再被抑制，当使用UV光进行观察时，MGIT培养管便会发出荧光。并且，荧光的强度直接与氧气的消耗成正相关。对于结核分枝杆菌来说，在阳性情况下，每毫升培养基中大约有10 5～10 6个菌落构成单元（cfu）。如果6周（42天）之后，该仪器仍为阴性，则表示培养管为阴性。
（二）适用范围
适用于分离标本中的分枝杆菌。
（三）检测样品
痰标本、咽拭子、胃灌洗液、其他体液标本、组织等。
（四）仪器设备
1.BACTEC TM MGIT TM960操作系统。
2.二级生物安全柜。
3.4℃冰箱。
4.冷冻离心机。
5.涡旋振荡器。
6.震荡混合器。
7.天平。
（五）试剂耗材
1.材料
（1）浓度足以杀灭结核分枝杆菌的消毒剂。
（2）污物桶，防液体飞溅。
（3）螺旋口试剂瓶（100ml、200ml）。
（4）量筒。
（5）磁性搅拌棒和搅拌器。
（6）50ml塑料一次性离心管。
（7）用于装50ml离心管的干净架子。
（8）计时器。
（9）2ml一次性、带容积刻度、无菌、单独包装移液管。
（10）2ml离心管。
（11）2ml冻存管。
（12）可调微量加样器（1000μl）。
（13）1ml无菌移液枪头。
（14）1ml无菌注射器。
（15）pH计或pH试纸。
（16）载玻片加温器（热板）。
（17）给载玻片加标记的铅笔。
（18）不褪色记号笔。
（19）载玻片，一端为磨砂质地。
2.试剂
（1）BACTEC TM MGIT TM960操作系统所用试剂:MGIT 7ml培养管和培养添加剂杂菌抑制剂（PANTA）。
（2）手工判读仪所用试剂:MGIT 4ml培养管、OADC营养添加剂、杂菌抑菌剂。
（3）BacT/ALERT 3D微生物检测系统所用试剂:BacT/ALERT MP处理瓶（红色瓶盖）、冻干的抗生素补充剂、MB/BACT复溶液。
（4）NALC（N-乙酰-L-半胱氨酸）粉末。
（5）6%NaOH溶液。
（6）2.9%枸橼酸钠溶液。
（7）pH 6.8磷酸盐缓冲液（0.067M）。
（8）萋-尼染色液。
3.设备及材料的准备
（1）检测前使冷冻待用的标本和试剂恢复至室温。
（2）将所需材料置于生物安全柜内，启动生物安全柜，预运行3～5分钟，检查生物安全柜运行是否正常。
（3）打开冷冻离心机电源，将温度设为8～10℃。
（4）在生物安全柜外将患者姓名编号标记在前处理管及培养管上。
（5）培养管的准备:
1）拿出MGIT 7ml生长指示管、生长添加剂、PANTA，检查MGIT生长指示管有无破损及污染（管中液体出现浑浊）。
2）将MGIT PANTA与15ml MGIT生长添加剂重新混合。
注意:该混合物在2～8℃可稳定保存7天。在保存前贴上标签，包括内容物、配制时间、有效期及配制人信息。若7天内不能用完，可当时分装，置于-20℃以下的温度，保存6个月。
3）在生长指示管上标记标本标号。
4）用移液枪在每个MGIT管内添加溶解后的0.8ml PANTA/生长添加剂混合物，注意操作不要污染管，盖紧MGIT管。
（六）操作步骤
为了更好地培养出结核分枝杆菌，痰标本的前处理很重要，主要目的是去除分枝杆菌外的其他细菌，并且液化标本中的有机残骸。
1.对照标记的患者姓名、编号，在生物安全柜内用2ml无菌移液管吸取痰液2～5ml至50ml离心管中。
2.视标本性状用移液管加1～2倍体积的NaOH/NALC-枸橼酸钠溶液。
3.旋紧管盖，在涡旋振荡器上涡旋振荡15～30秒，直到痰标本充分液化。
4.当把NaOH/NALC-枸橼酸钠溶液加到第一个标本时将定时器设在15分钟。把离心管放在转速60r/min震荡混合器上涡旋振荡。如果没有震荡混合器可以在液化期间轻柔地在涡旋振荡器上涡旋离心2～3次。
5.对随后的标本以30秒～1分钟的间隔重复步骤2～4。
6.确保所有标本完全液化。如果10分钟后仍然黏液样，加约50mg NACL粉末并震荡15～30秒。
7.到时间后，从震荡混合器上取下离心管。继续以30秒～1分钟的间隔在所有标本中加入磷酸盐缓冲液（pH 6.8）至离心管45ml标记处，颠倒混匀。保证每个标本只接触NaOH/NALC-枸橼酸钠溶液最多20分钟。
8.将离心机的离心桶移到生物安全柜中，把离心管放在离心桶中，盖好离心桶盖。
9.将离心桶放入离心机，保证已平衡并且拧紧离心桶盖，在8～10℃以3000g的转速（注意不是3000r/min）离心15分钟。
10.拿出离心桶，转移到生物安全柜中打开离心桶盖，取出离心管。
11.小心地把上清液倒在有分枝杆菌消毒剂的防溅出的容器内，注意不要倒出管底部的沉淀。
12.用2ml移液管加无菌的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）至沉淀物，最终体积为2.5ml。
在涡旋振荡器上涡旋离心2～3秒，使沉淀物重悬。
13.用无菌、有刻度、一次性的移液管吸取0.5ml悬浮液加到MGIT管中，盖紧MGIT管盖子并充分混匀（上下轻柔颠倒一次）。
14.把剩余的悬浮液分装在冻存管中（每管约1ml），在4℃冰箱中保存直到确认接种管没有被污染。
15.如果发现某一标本被污染，用剩余的沉淀物重复2～13的步骤。
16.孵育将MGIT 7ml管放入仪器内进行孵育，等待仪器自动报告结果。
液体培养结果登记本样式见附件7.液体培养实验室登记本示例。
（七）结果判读
1.仪器自动报告结果
2.阳性培养管的进一步处理 一旦MGIT培养管通过仪器报告或肉眼观察检查呈阳性，则应该准备涂片并使用萋-尼氏染色液进行染色。
（1）涡旋振荡使阳性培养管中液体混合，用2ml无菌移液管从MGIT7ml培养管吸取1ml液体至2ml无菌离心管中。
（2）对离心管进行离心，12 000r/min，5分钟。
（3）在生物安全柜中打开离心管，用移液管轻轻弃去上清，留下沉淀物及大约100μl液体。
（4）轻轻涡旋离心管2～3秒。
（5）用移液管吸取离心管中液体进行涂片。
（6）在火焰上加热数次或使用载玻片加温器在65～70℃的温度下加热2小时。
（7）以上1～6程序必须在生物安全柜内操作。
（8）进行萋-尼氏染色。
（9）在经过染色和完全风干的涂片上滴一滴镜油，在低倍物镜下观察染色细菌的位置。转至油浸物镜，仔细观察，确认是否是抗酸杆菌阳性，若为阳性则报告液体培养分枝杆菌阳性。
如果肉汤出现浑浊或污染，则不考虑抗酸杆菌涂片结果，使用血液琼脂、巧克力琼脂或TSI琼脂作为传代培养基，判断是否存在污染细菌。
如果涂片呈抗酸杆菌阴性，培养管未被污染（肉汤透明），则将培养管放入37℃培养箱中，7天后对涂片重新进行抗酸杆菌染色处理。若为阳性，则报告液体培养分枝杆菌阳性。若为阴性则报告液体培养阴性。
（八）质量控制
1.内部质量控制
（1）仪器的质量控制
1）请参考仪器操作说明，按照要求每天对仪器进行系统检测及维护。
2）每月打印质量控制报告（由仪器打印产生）。
（2）培养基的质量控制（MGIT培养管）
1）在接收培养管时，检查是否损坏或破裂，培养基未被污染，也没有外观改变。
2）记录接收培养基及添加剂的批号和有效期及数量。
3）建议接收新一批培养基时进行常规质量控制检测。推荐使用结核分枝杆菌H 37Rv。
菌液制备及接种操作过程。
①在磨菌瓶中加入1～2滴无菌10%吐温-80水溶液。
②用无菌接种环刮取在LJ培养基上生长1～2周的新鲜菌落，置于磨菌瓶中。
③注意:尽可能刮取斜面各个部位的菌落，避免挑取1、2个单独菌落进行试验，刮取菌落的量以半环或一环（5～10mg）为宜。
④旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上振荡20～30秒。
⑤静置5分钟，小心打开瓶盖，加入约2ml灭菌生理盐水，静置片刻，使菌液中的大块物质沉淀。
⑥用无菌吸管吸取上清菌液，约0.5ml，转移到另一无菌试管中，与标准麦氏比浊管（MacFarland No.0.5）比浊。
⑦逐渐滴加灭菌生理盐水，直至菌液浊度与标准麦氏比浊管（MacFarland No.0.5）一致。
⑧在标记好的MGIT培养管中添加0.8ml MGIT PANTA/Growth Supplement（杂菌抑制剂/生长添加剂）。
⑨将制备好的0.5McFarland菌液用无菌生理盐水做如下稀释，接种0.5ml于MGIT培养管中。
⑩将培养管放入BACTEC TM MGIT TM960操作系统或37℃培养箱中，若培养报阳时间为6～10天，则培养基质量合格，可以用于实验。
（3）抗酸染色质量控制:
在接收和制备新一批萋-尼染色液时，用已知阳性级别和阴性结果的痰涂片进行质量控制。
2.室间质量控制
同固体培养的质量控制。
3.质量提高
同固体培养的质量控制。
（九）注意事项
1.液体培养管的准备
（1）PANTA与生长添加剂混合后，2～8℃保存7天。
（2）在保存前贴上标签，包括内容物、配制时间、有效期及配制人信息。
（3）若7天内不能用完，可当时分装，置于-20℃以下的温度，保存6个月。
（4）在临接种样本时或接种样本前2小时内，加PANTA和OADC溶液。
2.标本前处理
（1）除非准备好向培养基里添加物质，否则始终要保持盖子盖牢。
（2）尽可能缩短打开试管的时间。
3.结果报告
（1）如果肉汤出现浑浊或污染，则不考虑抗酸杆菌涂片结果，使用血液琼脂、巧克力琼脂或TSI琼脂作为传代培养基，判断是否存在污染细菌。
（2）阳性管应该立即进行快速抗酸染色，若涂片为阴性，在5小时之内重新放入MGIT TM960操作系统继续培养。
（3）培养6周的阴性管应该肉眼观察是否发生污染（严重的混浊）进一步确诊。在丢弃试验管前应用肉眼检查是否有混浊或小颗粒存在，阴性管不可重复使用。
（4）对于假阳性结果处理方法:
1）检查消化/去污染步骤:是否加磷酸缓冲液至45ml、小心弃去上清夜、加1～3ml磷酸缓冲液，使沉淀混匀。因为NaOH能使pH增加，使生长被延迟或抑制，可能产生荧光，甚至可能使培养基变色；NALC是一种还原剂，也可能产生荧光，但通常会在1～2天后消失。
2）如果MGIT培养管报阳，而涂片阴性，可能因为染色时，样本被冲掉了，可以在加样本时，可在玻片上加一滴苯酚处理的兔血清或BSA（牛血清白蛋白）。
（十）临床意义
液体培养阳性一般作为快速培养分枝杆菌的方法，为临床诊断结核病缩短了时间。
（十一）自测试题
1.液体培养可以完全替代固体培养吗？
2.自动化系统是只能检测结核分枝杆菌生长吗？
3.不同自动化系统的主要特点是什么？
4.列出在接种液体培养时要遵守的重要注意事项。
5.液体培养中可接受的污染率是多少？
（十二）拓展文献
1.European Centre for Disease Prevention and Control.Mastering the basic of TB control:Development of a handbook on TB diagnostic methods.Stockholm:ECDC，2011
2.Partrik R.Murray.Manual of Clinical Microbiology.9 th ed.Washington:ASM Press，2007
3.Summary report of the Expert Group Meeting on the use of liquid culture media，Geneva，26March 2007: Use of Liquid TB Culture and Drug Susceptibility Testing（DST）in Low and Medium Income Settings
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5.The Global Laboratory Initiative.A Roadmap for Ensuring Quality Tuberculosis Diagnostics
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7.World Health Organization.Laboratory services in tuberculosis control.PartⅢCulture.Geneva 1998；publication No.WHO/TB/98.258
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9.赵雁林.分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册.北京:人民卫生出版社，2013
10.王甦民.结核病诊断实验室检验规程.北京:中国教育文化出版社，2006
11.卫生部疾病预防控制局，卫生部医政司，中国疾病预防控制中心.中国结核病防治规划实施工作指南.2008
12.唐神结，高文.临床结核病学.北京:人民卫生出版社，2011
13.陈明亭，万康林.结核病实验室技术手册.北京:科学出版社，2011
14.中华人民共和国卫生部.肺结核诊断标准WS 288-2008.
15.赵雁林，刘志敏.结核病实验室标准化操作与网络建设.北京:人民卫生出版社，2013
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