细菌生长时会产生或消耗气体，仪器通过压力感应器感应培养瓶内的压力变化，从而判断是否有细菌生长。Versa TREK/ESP培养系统Ⅱ通过自动监视培养基瓶子顶部的氧气消耗量来查看结核菌的生长，并且通过报警方式反映出来。

适用于分枝杆菌快速培养。

呼吸道样本（包括痰液、肺泡灌洗液等）、体液（如CSF、关节液、胸腔积液等）、尿液、粪便、胃液、组织液、血液及骨髓等。

VersaTREK血培养仪，生物安全柜，高速离心机，高压灭菌锅。

VersaTREK Myco:VersaTREK分枝杆菌培养瓶

VersaTREK Myco GS:促生长剂

VersaTREK Myco AS/PVNA:抑菌剂（两种制剂含有复合抗生素干粉，复融于25ml水中）

Sensititre ^ⓇMYCOTB（MYCOTB）药敏板

1ml一次性注射器

5ml一次性注射器

消毒灭菌的50ml圆锥离心管

pH 6.8磷酸盐缓冲液

磷酸二氢钾

氢氧化钠粉末

枸橼酸钠

N-乙酰-L-半胱氨酸粉末

75%乙醇

棉签

N95口罩帽子手套防护服

Vizion/SWIN系统［V2020］

Middlebrook 7H9w/OADC［T3440］

Saline Tween with glass beads［T3490］（带玻璃珠的生理盐水）

0.5McFarland标准比浊管［E1041］

50or 100μl移液枪及Tip头

质控菌株:结核分枝杆菌ATCC 27294和25177

Middlebrook 7H10agar plates或固体培养基

血琼脂平板

35～37℃孵育箱（非CO ₂培养）

涡旋振荡器

接种槽或空有盖培养皿

Manual Viewer［V4007］

Doseheads［E3010］（AIM加样头）

将2.92%枸橼酸钠和8% NaOH等量混匀，高压灭菌，冰箱内保存备用（消化液），临用前将50ml消化液加入0.25g NALC，混匀，该液体不稳定，24小时内用完。

除上述消化处理液外，还可以使用4%NaOH或者4%H ₂SO ₄作为消化处理液。

取0.2mol/L（27.2g/L）磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L（8g/L）氢氧化钠溶液118ml，用去离子水稀释至1000ml，摇匀，即可使用。

所有标本操作均应在生物安全柜内进行，包括呼吸道样本（包括痰液、肺泡灌洗液等）、体液（如CSF、关节液、胸腔积液等）、尿液、粪便、胃液、组织液、血液及骨髓等。

取5ml痰液加入有标记的50ml的带盖的离心管中，加入等量的N-乙酰半胱氨酸-氢氧化钠（NACL-NaOH）前处理液（去污染），涡旋振荡混匀20秒，静置15分钟（不超过20分钟），即无菌PBS（pH 6.8）至50ml盖紧，离心3000r/min 15min，倒掉上清液，加1～3ml PBS（pH 6.8）以中和pH至6.8。

1）无菌体液直接接种。

2）如标本量＞10ml，离心3000r/min，15min，取沉淀物接种。

3）污染标本同痰液处理方法，需处理后再接种。

在接种入培养瓶前须选择以下两种方法中的一种进行处理:

①用含SPS（聚茴香磺酸钠）或肝素的无菌真空采血管管采集5～10ml全血（最少5ml），混匀数次后使用。

②把样本转入50ml尖底离心管内。

③加无菌蒸馏水到40ml，使管内细胞溶解。

④3000r/min离心20分钟去上清。

⑤在沉淀中加入1～2ml磷酸盐缓冲液混匀，取其中1ml样本接种入分枝杆菌的培养瓶中。

①用含SPS（聚茴香磺酸钠）或肝素无菌真空采血管采集5～10ml全血（最少5ml），颠倒混匀数次后使用。EDTA抑制分枝杆菌生长，故EDTA抗凝管不能使用。

②1000r/min离心，10分钟取出。

③使用移液枪吸取白膜层（可能会带有少量红细胞），放入无菌管内，吸取1ml接种入分枝杆菌的培养瓶中。

以下步骤应在生物安全柜内操作（图4-2）:

1.乙醇消毒VersaTREK Myco AS或者PVNA瓶盖。

2.注射器取25ml无菌蒸馏水或离子水注入VersaTREK Myco AS或者PVNA瓶中，混匀溶解（可使用50次）。

3.乙醇消毒VersaTREK Myco培养瓶盖，吸取1ml的VersaTREK Myco GS注入培养瓶中。

4.注射器吸取0.5ml上述VersaTREK Myco AS或者PVNA溶解液注入培养瓶中。

5.注射器吸取1ml浓缩的样本到培养瓶中。

注:同时可接种0.1ml样本到Middlebrook 7H10琼脂或其他固体培养基上。

6.用分枝杆菌消毒剂擦拭培养瓶和瓶盖。

7.颠倒混匀培养瓶数次。

8.打开VersaTREK连接器封膜，垂直把连接器的针头插入培养瓶。

注:当连接器插入瓶后不能再颠倒培养瓶，因为液体进入到连接器的针头内，会干扰仪器对压力的监测。

9.把装有连接器的培养瓶放入VersaTREK血培养仪自动孵育监测（在仪器孔位放入分枝杆菌适配器）。

肉汤需预温至室温后使用。

1.从琼脂平板上刮取菌落然后乳化到含2%吐温带玻璃珠的生理盐水中。用于测试的菌种培养不要超过5周。

2.漩涡振荡器混匀至少30秒。

3.使用肉眼或Sensititre比浊仪调整菌液浓度至0.5麦氏浓度，如使用Sensititre比浊仪，请使用0.5麦氏标准管（E1041）校准仪器，在15分钟内完成。

4.吸取100μl菌悬液到Middlebrook 7H9w/OADC肉汤中，漩涡振荡器混匀30秒，使接种液最终的浓度为1×10 ⁵cfu/ml（5×10 ⁴～5×10 ⁵cfu/ml）。

步骤1～4必须在30分钟内完成。同时需进行菌落纯度检查。

5.使用全自动菌液接种仪（AIM）或8道加样枪接种菌液倒药敏板中（药物及浓度见表4-4），每孔加100μl。操作中药敏板上的标签对准操作者，加样枪需要定期保养或定标，假如利用Sensititre ^ⓇAutoinoculator ^Ⓡ/AIM ^Ⓡ接种要使用专用的加样头。接种步骤应在30分钟内完成。要定期核对阳性对照孔的菌落数，接种液菌落计数应为1×10 ⁵ cfu/ml（5×10 ⁴～5×10 ⁵）。

6.在药敏板上覆膜，确保每个孔都完整地覆盖，避免褶皱。用消毒剂擦拭药敏板覆膜的表面，然后放入温箱孵育。建议消毒剂为酚类的复合物，如苯酚。

7.35～37℃有氧环境孵育10天后察看结果，如生长较少，重新放入温箱孵育继续孵育，到第21天，然后观察结果。在培养过程中，药敏板最多堆积两块的高度。

8.菌落纯度检查。为了确保检测的菌落为单一细菌，无污染，菌落纯度检查时必需的。从Middlebrook 7H9-OADC菌液中取50μl接种于血平板及Middlebrook 7H10平板上。血平板35～37℃，培养48～72小时，7H10平板孵育至8周，以检测有无污染。

1.当仪器提示阳性时，从VersaTREK血培养仪中取出培养瓶移入生物安全柜，取下连接器，连接器应放入利器盒内。

2.彻底混匀培养瓶，使细菌从海绵中释放出来。

3.消毒瓶盖后，用注射器吸取培养瓶内的液体作抗酸染色；如涂片发现有抗酸杆菌，可进行菌种的鉴定。

4.如涂片未发现抗酸杆菌，可再加上一个连接器重新放入仪器内继续培养。

5.如涂片发现不是抗酸杆菌，可把瓶内容物再一次去污染浓缩后，重新按照上述方法接种入一个新的培养瓶，再次放入仪器培养或者丢弃重新采样。

6.一个培养瓶在培养42天后，如未报告阳性，仪器会提示阴性。

7.从仪器中取出培养瓶后，观察瓶内的液体是否混浊。如混浊，可取瓶内液体作抗酸染色，以确定是否有分枝杆菌生长。如瓶内液体无混浊，可认为此标本为阴性，培养瓶高压消毒后丢弃。

1.可使用Sensititre ^Ⓡmanual viewer或Vizion ^ⓇSystem进行结果判读。判读过程中是板条上有条码标签的一侧对准使用者，无需去掉封膜。生长表现为浊度或菌落沉积在反应孔底部。记录生长明显减少的最低的抗生素浓度为MIC值（图4-3）。

2.首先应读阳性对照孔，假如没有任何生长，结果无效。

3.以下几点需要注意

（1）污染

1）污染可能会导致一个孔内有生长，周围邻接孔没有生长。

2）单孔的污染可以忽略。

3）多孔的污染，需要重新试验。

（2）跳孔

1）偶尔情况下会出现“跳孔”情况，即一个孔没有生长，周围邻接孔有生长。这种情况由许多不同原因造成，包括:污染、突变、密封膜褶皱和错误的接种。

2）单一孔跳孔可以忽略。为了保证抗生素的有效治疗，不要将跳孔判读为MIC值，应该选择连续没有生长的最低药物浓度孔。

3）两孔以上跳孔需重新试验。

1.每天系统会自动监测仪器的温度。温度探头位于每个单元内并记录仪器的实际温度，计算每天平均温度用来汇报。

2.VersaTREK的温度应该在温度控制设定的35℃以内。用户应该使用校准的温度计每天检测仪器内部温度。仪器的每个显示器应该显示单元的实际温度。

无论检测位置上是否放有样本，VersaTREK内的所有检测位置会被VersaTREK仪器自动监测。仪器将会在12分钟内发送更新的传感器＂错误＂状态到传感器质量控制数据库。如果＂错误的＂状态持续存在，系统会提示用户屏蔽那个位置。用户不需要额外的工作量来完成传感器质量控制。

仅用于体外诊断。

1.参照VersaTREK Myco AS/PVNA材料数据了解危害信息。所有样本具有潜在危害。样本中可能存在致病因子，试剂中含有动物源性物质，有携带和传播疾病的潜在风险，遵照通用预防措施及感染性废弃物处理原则。

2.操作结核分枝杆菌推荐的生物安全级别为BSL-3级，包括污染的设备和设施。

3.VersaTREK连接器打开封盖时内部的针头是无菌的，但使用后可能有潜在危害。按感染血液制品处理和丢弃（不能随意处理，丢弃前要高压灭菌，然后丢入利器盒内，不能重复使用）。

4.肉眼观察所使用的培养瓶是否污染、破裂及变质的迹象，不可使用已经混浊或破损的培养瓶。

5.VersaTREK Myco培养瓶丢弃前应高压灭菌。加入连接器的封口已破损，不要再使用，要丢入利器盒内。

VersaTREK培养系统优点是操作简便，不易污染，检测时间短，灵敏度高。既能做分枝杆菌的快速鉴定，又能检测其药物敏感性，进而指导临床用药。但其监测系统有待进一步完善。与传统方法比较，VersaTREK培养系统加快了结核分枝杆菌培养的速度，有助于临床快速诊断。